靶点：HSET;Kinesin 通路：Cytoskeleton 背景说明：CW069 是一种变构选择性microtubule motor protein HSET抑制剂。 生物活性：CW-069 是一种 HSET 的别构抑制剂，IC50 值为 75 μM[1]。 IC50：HSET:75μM [1] In Vitro：CW-069是HSET的变构抑制剂，IC50为75μM。 CW-069显示出比KSP更具统计学意义的选择性。 CW-069有效抑制N1E-115细胞，并且有效抑制NHDF细胞，IC50分别为86±10μM和181±7μM。 CW-069(100或200μM)导致具有超数中心体的N1E-115细胞中增加的多极纺锤体，并且对改变正常人真皮成纤维细胞中的双极纺锤体形态没有影响。 CW-069(200μM)通过HSET siRNA转染在N1E-115细胞中诱导多极后期和细胞死亡，并通过monastrol拮抗KSP的抑制，但不在HeLa细胞中发挥有丝分裂停滞[1]。 细胞实验：通过STR基因分型验证NHDF细胞，HeLa细胞，BT549，MCF-7和MDA-MB-231细胞，并且所有测试的支原体均为阴性。将细胞在补充有10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中于37℃和5％CO 2下培养。将磺酰罗丹明B比色(SRB)测定中使用的所有化合物(CW-069)溶解在DMSO中并在培养基中稀释至终浓度为0.2％DMSO。对于SRB测定和活细胞成像，将细胞以每孔2，500个细胞的密度接种在96孔板中。 24小时后，用化合物(CW-069)处理细胞72小时，每种浓度一式三份孔。对于SRB测定，然后用三氯乙酸(TCA)固定细胞并用SRB染色。使用Infinite 200 PRO读板仪在545nm的波长下定量荧光。将化合物(CW-069)处理的孔与溶剂对照孔进行比较，并将导致50％溶剂对照细胞生长的化合物浓度指定为IC50浓度，使用Graphpad PRISM 6计算。至少三个生物学重复每次测定都进行[1]。 激酶实验：该方案针对全长，N末端，6His标记的HSET和KSP进行了优化，并测量了MT刺激的蛋白质活性。通过将ATP的水解与经丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶反应氧化NADH相结合，通过分光光度法观察到HSET/KSP的Gsp合成酶活性的抑制。通过将纯化的Gsp合成酶/酰胺酶(12.8nM)加入含有以下组分(终浓度)的测定混合物中来启动测定：6nM蛋白质，0.07mg/mL MT，1.56mM谷胱甘肽，10mM亚精胺，2mM ATP，在50 mM Na PIPES(pH 6.8)中加入2.7 mM MgCl 2，1 mM磷酸(烯醇)- 丙酮酸，0.2 mM NADH，50μg/ mL乳酸脱氢酶，100μg/ mL丙酮酸激酶和各种浓度的抑制剂(CW-069))在37°C。进行ADP-Glo检测测定。使用多点BioMek Nxp进行所有化合物添加。使用Pherastar酶标仪读取平板[1]。 数据来源文献：[1]. Watts CA， et al. Design， synthesis， and biological evaluation of an allosteric inhibitor of HSET that targets cancer cells with supernumerary centrosomes. Chem Biol. 2013 Nov 21;20(11):1399-410.
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